ПЛР Набори GENEPROOF для визначення інфекцій в трансплантології

Трансплантація органів — одне з найбільших досягнень медицини ХХ століття, – продовжує життя і покращує якість сотням тисяч пацієнтів по всьому світу. Численні акти самопожертви з боку донорів органів і їх сімей, також як і численні значні наукові і клінічні успіхи, досягнуті медиками, перетворили трансплантацію не тільки у спосіб порятунку життя, а й у символ людської солідарності [1].

Щороку в Україні близько 5 000 людей потребують пересадки органів. Для них ця операція – єдиний шанс на життя. Впродовж десятиліть після проголошення незалежності питання порятунку людей, які потребують пересадки, «висіло в повітрі». Проводились лише поодинокі посмертні органні трансплантації. Водночас від живого донора було проведено всього кілька десятків пересадок.

Поворотним моментом у трансплантації стало прийняття змін до Закону «Про застосування трансплантації анатомічних матеріалів людині» від 20.12.2019 року. Тоді ж, після значної перерви, в Ковельській районній лікарні за участі столичних лікарів було проведено трансплантацію серця і нирок від померлого донора [2].

(Джерело посилання — https://media.istockphoto.com/)

Пацієнти з ослабленим імунітетом особливо вразливі до звичайних або опортуністичних вірусних інфекцій. Вони часто виникають після трансплантації солідного органу або гемопоетичних клітин, що супроводжується захворюваністю та смертністю до 40%. Такі інфекції можуть походити від донора, бути позалікарняними або відповідати реактивації існуючих латентних ендогенних вірусів пацієнта.

Успішна профілактика та раннє виявлення вірусних інфекцій, включаючи реактивацію, є основними принципами ведення пацієнтів з трансплантатами. Для ефективних стратегій превентивного та терапевтичного лікування важлива точна кількісна оцінка вірусного навантаження. Як правило, в імунокомпрометованих організмах реактивація декількох вірусів може відбуватися одночасно, що робить всебічну ідентифікацію патогенних вірусів, які реплікуються, вкрай важливою. Моніторинг опортуністичних вірусних інфекцій у пацієнтів після трансплантації найчастіше виконується за допомогою кількох кількісних ПЛР-аналізів.

Серед виробників наборів в молекулярній діагностиці для досліджень пацієнтів із ослабленим імунітетом чи трансплантованими органами для ПЛР представлена всесвітньовідома компанія GeneProof.

GeneProof — це біотехнологічна компанія, що працює в області молекулярної діагностики серйозних інфекцій і генетичних захворювань in vitro [3].

Портфоліо GeneProof в першу чергу зосереджене саме на інфекційних захворюваннях вірусного та бактеріального генезу. Приділяючи особливу увагу якості, GeneProof пропонує технологічно передові набори для ПЛР у режимі реального часу [4].

Рішенням від GeneProof для діагностики пацієнтів із ослабленим імунітетом чи з трансплантованими органами є наступні набори:

Цитомегаловірус (CMV)

Цитомегаловірус людини є поширеною опортуністичною інфекцією серед осіб з ослабленим імунітетом. Імунітет таких людей максимально ослаблений через застосування імуносупресії під час трансплантації солідних органів або трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин (ТГСК), а, отже, вони схильні до реактивації CMV людини (латентного вірусу), первинної інфекції та реінфекції.

Інфекції CMV можуть спричиняти важкі захворюваності та невдалі трансплантації, що часто призводить до тривалого перебування в стаціонарі та значно вищих витрат на лікування. Трансплантація від серопозитивної особи серонегативній (R-/D+) становить найбільший ризик розвитку CMV-асоційованого захворювання у пацієнтів-реципієнтів. Тому визначення серологічного статусу реципієнта і донора є важливим для оцінки ризику розвитку CMV-асоційованих захворювань. Однак знайти донора та реципієнта з однаковим серостатусом може бути важко, та навіть збіг серостатусу не повністю виключає ризик CMV-асоційованої захворюваності.

Скоординована вроджена та адаптивна імунна відповідь має вирішальне значення для контролю CMV-інфекції у реципієнтів з ослабленим імунітетом. У той час як вроджені реакції інтерферону (IFN) і природних кілерів (NK) важливі для безпосереднього контролю над CMV-інфекцією, адаптивні Т-клітинні імунні реакції важливі як на стадії активної інфекції, так і на стадії контролю реактивації [5].

Вірус Епштейна-Барр (EBV)

Вірус Епштейна-Барр — широко розповсюджений вірус герпесу, який інфікує більшість населення в усьому світі. Вірус може створювати довічну латентну інфекцію в В-лімфоцитах господаря. В умовах імунологічного компромісу, як це відбувається після трансплантації, вірус може реактивуватися і викликати одне з найсмертоносніших ускладнень після трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин (ТГСК) — постлімфопроліферативну хворобу (ПЛПХ), частота виникнення якої постійно зростає. З виникненням ПЛПХ пов'язані численні фактори ризику, такі як вік, зниження інтенсивності кондиціонування, невідповідність серології EBV та реактивація цитомегаловірусу. Рідкісність клінічних досліджень, що включають ПЛПХ, і відсутність затверджених методів лікування роблять лікування ПЛПХ складним завданням [6].

Вірус BK (BKV) та JC-вірус (JCV)

Віруси поліоми повсюдно інфікують багато різних видів ссавців, зокрема і людей. Відомо п'ять вірусів поліоми людини. Більшість захворювань на поліому людини викликаються вірусами BK і JC, які зазвичай набуваються в дитинстві.

Приблизно 50-80% людей є серопозитивними до цих вірусів. Клінічно виражені захворювання в імунокомпетентних носіїв трапляються вкрай рідко. Ці віруси залишаються латентними, ймовірно, в лімфоїдних органах, нейронній тканині та нирках, а за умов вираженої імуносупресії обидва віруси реактивуються. Нейротропний вірус JC (JCV — вірус Джона Каннінгема, John Cunningham) досягає головного мозку та викликає прогресуючу мультифокальну лейкоенцефалопатію (ПМЛ), демієлінізуюче захворювання центральної нервової системи з високим рівнем смертності. Вірус ВК є уротеліотропним, і його реактивація викликає форму інтерстиціального нефриту, відому як ВК або вірусоасоційована нефропатія, яка пов'язана з високою втратою трансплантата, якщо її не розпізнати на ранній стадії. Ефективних противірусних препаратів проти жодного з вірусів поліоми не існує [7].

Вірус BK, що вперше виділений у 1971 році, є значним фактором ризику дисфункції ниркового трансплантата та втрати алотрансплантата. На жаль, можливості лікування BK-інфекції обмежені, а ефективної профілактики не існує. Хоча надмірна імуносупресія залишається основним фактором ризику інфікування ВК після трансплантації, чоловіча стать, старший вік реципієнта, попередні епізоди відторгнення, ступінь невідповідності лейкоцитарних антигенів людини, тривалий час холодової ішемії, серостатус ВК та встановлення дренажного стента в сечоводі також були визнані факторами ризику. Доведено, що рутинний скринінг на ВК є ефективним для запобігання втраті алотрансплантата у пацієнтів з вірурією або віремією BK-інфекції. Зменшення імуносупресії залишається основою лікування ВК-нефропатії і є найбільш вивченим втручанням. Лабораторні методи, такі як ELISPOT-аналіз, надали нове розуміння імунної відповіді на ВК і можуть допомогти спрямувати терапію в майбутньому.

Вірус ВК можна виявити як у крові, так і в сечі. Після реактивації ВК вірус спочатку виявляється в сечі, а віремія розвивається через кілька тижнів. Вірусне навантаження ВК вимірюється за допомогою ПЛР у режимі реального часу [8].

Аденовірус

Аденовіруси як безоболонкові літичні дволанцюгові ДНК-віруси викликають переважно респіраторні, шлунково-кишкові або кон'юнктивальні захворювання в імунокомпетентних пацієнтів протягом року.

Незважаючи на відсутність консенсусу щодо визначень аденовірусної інфекції та захворювання, зазвичай безсимптомна аденовірусна інфекція визначається як виявлення аденовірусу у пацієнтів у зразках калу, крові, сечі або верхніх дихальних шляхів (за допомогою вірусної культури, тестів на антигени або ПЛР методів) за відсутності ознак і симптомів, пов'язаних з аденовірусним захворюванням.

Аденовірусна хвороба визначається як наявність відповідних ознак і симптомів з боку органів у поєднанні з виявленням аденовірусу в біоптаті (імуногістохімічне забарвлення) або в бронхоальвеолярному лаважі чи спинномозковій рідині (культуральне дослідження, виявлення антигену або ПЛР), за відсутності іншого діагнозу. Позитивний результат ПЛР аденовірусу з тканини або рідини і негативний результат імуногістохімічного дослідження не свідчить про інвазивне захворювання. Позитивний результат ПЛР аденовірусу з тканини або рідини важко інтерпретувати за відсутності імуногістохімічного підтвердження. Аденовірусна хвороба вважається дисемінованою, якщо залучено два або більше органів, не враховуючи віремію. Здатність аденовірусу до латентного стану може призвести до труднощів в інтерпретації наявності ДНК у клінічних зразках.

Доступними методами діагностики аденовірусних інфекцій є: вірусна культура, пряме виявлення антигену, молекулярні методи та гістопатологія. Серологія та електронна мікроскопія доступні, але не використовуються в клінічній практиці [9].

Aspergillus

За останні роки кількість пацієнтів, яким проводять трансплантацію, зросла в експоненціальному порядку. Реципієнти трансплантатів є однією з найбільш значущих підгруп імуносупресованих осіб, які мають ризик розвитку інвазивного аспергільозу [ 10 ].

Види Aspergillus є основною причиною занепокоєння здоров'я людей з ослабленим імунітетом у всьому світі. Опортуністичні аспергіли викликають інвазивний алергічний аспергільоз, тоді як неінфекційні аспергіли сприяли розумінню біології еукаріотичних організмів і слугують модельним організмом. Морфотипи аспергіл, такі як конідії або міцелій/гіфи, допомагають їм виживати в сприятливих або несприятливих умовах навколишнього середовища. Ці морфотипи сприяють вірулентності, патогенності та інвазії в організм хазяїна шляхом виділення білків, ферментів або токсинів [11].

Аспергільоз може бути доведений лише гістологічним дослідженням або посівом з фізіологічно стерильного джерела. Теоретично це може бути культура крові, але в клінічній практиці ріст аспергілів з крові надзвичайно рідкісний. Окрім виявлення антигенів у крові та інших клінічних зразках, виявлення специфічних послідовностей грибкового геному є ще одним методом, перспективним для ранньої діагностики. З 1990-х років різні методи ПЛР використовуються для виявлення циркулюючої грибкової ДНК [12].

Вірус простого герпесу 1/2 (HSV-1/2)

Віруси простого герпесу є одними з найбільш поширених серед інфекцій людини. У більшості випадків інфекції HSV у людей з неушкодженою імунною системою протікають відносно м'яко і можуть викликати дискомфорт, але часто залишаються непоміченими. У рідкісних випадках HSV може потрапляти в кров, що призводить до більш тяжких проявів, які вражають різні ділянки шкіри, внутрішні органи та центральну нервову систему. Це особливо актуально для новонароджених та осіб з ослабленим імунітетом, для яких інфікування або реактивація HSV може становити загрозу для життя.

У реципієнтів трансплантації солідних органів інфікування або реактивація HSV також може призвести до більш тяжких проявів, включаючи езофагіт, гепатит, пневмоніт і потенційну втрату трансплантата. Тому діагностика інфекцій, спричинених HSV, має вирішальне значення в клінічних умовах. Рання діагностика дозволяє своєчасно призначити противірусне лікування, впливає на рішення щодо ведення пацієнтів з високим ризиком і може сприяти скороченню термінів перебування в лікарні, тим самим зменшуючи витрати на охорону здоров'я.

Для діагностики інфекцій, спричинених HSV-1 та HSV-2, застосовуються різні методи, включаючи традиційні вірусні культури, серологічні тести та тести ампліфікації нуклеїнових кислот (NAAT). Серед даних методів діагностики широко використовуються ПЛР-методи завдяки своїй високій чутливості та специфічності, а також короткому часу виконання для виявлення вірусної нуклеїнової кислоти [13].

Вірус герпесу 6 та 7 типу (HHV-6/7)

Останніми роками зростає інтерес до ролі вірусу герпесу людини 6 та 7 типу як нових патогенів або копатогенів у реципієнтів трансплантатів. HHV-6 та HHV-7 належать до родини β-герпесвірусів і тісно пов'язані з іншим представником цієї родини — цитомегаловірусом. Після первинного інфікування ці віруси залишаються латентними в організмі людини і можуть реактивуватися після трансплантації. Різні клінічні процеси, такі як лихоманка, висип, пневмоніт, енцефаліт, гепатит і мієлосупресія, були описані в асоціації з герпесвірусом. Більше того, зростає кількість доказів того, що основний вплив реактивації HHV-6 і HHV-7 при трансплантації пов'язаний з непрямими ефектами, такими як їх зв'язок з цитомегаловірусною хворобою, збільшенням кількості опортуністичних інфекцій, а також дисфункцією і відторгненням трансплантата. Патогенез HHV-6 і HHV-7 у посттрансплантаційному періоді, методи їх діагностики, а також оцінка противірусних препаратів і стратегій їх профілактики та лікування зараз є предметом широких досліджень [14].

Вірус герпесу людини 8 типу (HHV-8)

Вірус герпесу людини 8 ( HHV-8) — це географічно обмежений вірус, який викликає неопластичні захворювання переважно в ендемічних регіонах. Первинна інфекція HHV-8, яка зазвичай протікає безсимптомно в імунокомпетентних осіб, призводить до довічної латентності. Коли рівновага між вірусом та імунітетом хазяїна порушується, наприклад, після трансплантації органів, HHV-8 може активувати молекулярні шляхи, які призводять до онкогенезу.

Саркома Капоші, первинна лімфома та хвороба Кастлемана є основними злоякісними захворюваннями, що асоціюються з HHV-8. Частота виникнення цих неопластичних патологій відображає географічну поширеність серопозитивності HHV-8, а певні групи пацієнтів піддаються підвищеному ризику.

У цьому контексті ризик інфікування HHV-8 та його клінічних проявів є найвищим у пацієнтів з ослабленим імунітетом, включаючи реципієнтів трансплантатів.

У реципієнтів солідних органів із ендемічних регіонів може розвинутися реактивація HHV-8 або первинна інфекція, що проявляється саркомою Капоші або, рідше, первинною ефузійною лімфомою (ПЕЛ) та хворобою Кастлемана; ці неопластичні захворювання значно рідше реєструються в регіонах з низьким рівнем поширеності вірусу.

Наразі не існує стандартного методу скринінгу HHV-8 інфекції при трансплантації, хоча ПЛР-метод HHV-8 доступний для підтвердження клінічної підозри на інфекцію [15].

Парвовірус В19

Парвовірус В19 є поширеним, широко розповсюдженим патогеном людини. Це невеликий одноланцюговий лінійний ДНК-вірус без оболонки. Його генетична мінливість у світі є низькою, та немає чіткої кореляції між генотипом і характерними клінічними проявами. Парвовірус В19 найбільш ефективно і переважно реплікується в попередниках еритроцитів людини. Більшість людей інфікуються у віці від 5 до 15 років; у дорослому віці до 80% є серопозитивними.

Інфекція, надає довічний імунітет імунокомпетентним носіям, але повторне інфікування можливе в меншості випадків. Існує гіпотеза, що парвовірус B19 може персистувати в кістковому мозку та інших тканинах, підтримуючи можливу реактивацію, а не реінфекцію у деяких серопозитивних пацієнтів. Інфекція, що спричинена парвовірусом B19, може протікати як симптоматично, так і безсимптомно, залежно від віку, гематологічного та імунологічного статусу носія. Хоча більшість пацієнтів мали лише неспецифічні грипоподібні симптоми, з інфекцією Parvovirus B19 пов'язані відмінні клінічні прояви як у імунокомпетентних носіїв, так і у реципієнтів трансплантації солідних органів.

Сучасне використання методу ПЛР значно покращило виявлення вірусної ДНК. Однак деякі ПЛР тести не здатні виявляти штами, відмінні від В19 (генотипи 2 і 3). Крім того, ДНК парвовірусу В19 може бути виявлено за допомогою ПЛР у сироватці крові деяких пацієнтів протягом тривалого часу після гострої фази інфекції. Таким чином, позитивний результат ПЛР на парвовірус В19 необхідно ретельно інтерпретувати в контексті клінічної ситуації та інших лабораторних результатів [16].

Varicella-Zoster (VZV)

Вірус вітряної віспи (Varicella-zoster virus) — це повсюдно поширений високонейротропний, виключно людський α-герпесвірус. Первинне інфікування зазвичай призводить до вітряної віспи, після чого VZV стає латентним у нейронах черепно-мозкових нервових гангліїв, дорсальних корінцевих гангліїв та вегетативних гангліїв вздовж усього невраксису. Оскільки з віком у людей відбувається природне зниження клітинного імунітету до VZV, вірус часто реактивується і викликає оперізуючий (оперізувальний) лишай, який характеризується макулопапульозним або везикулярним висипом і дерматомікроскопічним болем, що поширюється по всьому тілу. Біль та висип зазвичай з'являються протягом декількох днів [17].

Точні лабораторні дослідження можуть бути використані в різних випадках VZV або оперізувального герпесу і повинні регулярно проводитися при підозрі на дисеміновані, вісцеральні захворювання або захворювання центральної нервової системи. Методами вибору є швидкі методи діагностики, включаючи ПЛР і прямий флуоресцентний аналіз (ПФА). ПЛР тестування є найчутливішим тестом на VZV, що може бути використаний для виявлення вісцерального ураження у везикулярній рідині, сироватці, спинномозковій рідині та інших тканинах [18].

ВИСНОВКИ

Отже, у зв’язку із зростаючими темпами трансплантацій в Україні починаючи із кінця 2019 року, кількість ПЛР досліджень лише зростає як для донорів, так і для реципієнтів. ПЛР діагностику часто проводять превентивно, з метою запобігання захворювань у реципієнтів трансплантації, а також для діагностики гострого або реактивованого захворювання та моніторингу відповіді на терапію. Набори GeneProof допоможуть досліднику у поставлених задачах. Висока якість даних наборів та простота виконання досліджень включають в себе наступні основні пункти:

один робочий процес дозволяє об'єднати ПЛР-набори з різних діагностичних груп в одному тесті за допомогою універсального ПЛР-протоколу, а універсальний ПЛР-протокол дозволяє одночасно визначати декілька параметрів в одному циклі, навіть ДНК і РНК патогенів одночасно;
універсальний внутрішній контроль — ще один крок до спрощення робочого процесу в лабораторії, особливо коли кілька досліджень об'єднуються в одній постановці; використання лише одного універсального внутрішнього контролю на початку процесу замість додавання кількох конкретних внутрішніх контролів сприятиме ще більшій ефективності;
подвійне визначення мішеней забезпечує правильну ідентифікацію патогенів і високу чутливість завдяки одночасному виявленню двох незалежних ділянок генів ДНК/РНК.

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ

1. www.utcc.gov.ua/transplantatsiya/pytannya-shho-stavlyatsya-najchastishe/

2. www.moz.gov.ua/uk/transplantacija-v-ukraini-jak-zminilas-galuz-za-ostanni-4-roki

3. www.geneproof.com/about-geneproof/t1054

4. www.geneproof.com/benefits-of-geneproof-pcr-kits/t1105

5. Sezgin, E., An, P., & Winkler, C. A. (2019). Host Genetics of Cytomegalovirus Pathogenesis. Frontiers in Genetics, 10. doi:10.3389/fgene.2019.00616.

6. Al Hamed, R., Bazarbachi, A. & Mohty, M. Epstein-Barr virus-related post-transplant lymphoproliferative disease (EBV-PTLD) in the setting of allogeneic stem cell transplantation: a comprehensive review from pathogenesis to forthcoming treatment modalities. Bone Marrow Transplant 55, 25–39 (2020). https://doi.org/10.1038/s41409-019-0548-7.

7. Boothpur R, Brennan D.C. Human polyoma viruses and disease with emphasis on clinical BK and JC. J Clin Virol. 2010 Apr;47(4):306-12. doi: 10.1016/j.jcv.2009.12.006

8. Deirdre Sawinski, Simin Goral, BK virus infection: an update on diagnosis and treatment, Nephrology Dialysis Transplantation, Volume 30, Issue 2, February 2015, Pages 209–217, https://doi.org/10.1093/ndt/gfu023.

9. Florescu DF, Schaenman JM; AST Infectious Diseases Community of Practice. Adenovirus in solid organ transplant recipients: Guidelines from the American Society of Transplantation Infectious Diseases Community of Practice. Clin Transplant. 2019 Sep;33(9):e13527. doi: 10.1111/ctr.13527.

10. Singh N, Paterson DL. 2005. Aspergillus Infections in Transplant Recipients. Clin Microbiol Rev 18: https://doi.org/10.1128/cmr.18.1.44-69.2005.

11. Shankar, J., Tiwari, S., Shishodia, S. K., Gangwar, M., Hoda, S., Thakur, R., & Vijayaraghavan, P. (2018). Molecular Insights Into Development and Virulence Determinants of Aspergilli: A Proteomic Perspective. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 8. doi:10.3389/fcimb.2018.00180.

12. Maschmeyer, G., Haas, A., & Cornely, O. A. (2007). Invasive Aspergillosis. Drugs, 67(11), 1567–1601. doi:10.2165/00003495-200767110-00004.

13. Zhen W, Sheikh F, Breining DA, Berry GJ. 2024. Rapid diagnosis of herpes simplex virus 1 and 2 bloodstream infections utilizing a sample-to-answer platform. J Clin Microbiol 62:e00131-24. https://doi.org/10.1128/jcm.00131-24.

14. Natividad Benito, Asunción Moreno, Tomás Pumarola, M.ª Ángeles Marcos, Virus del herpes humano tipo 6 y tipo 7 en receptores de trasplantes, Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, Volume 21, Issue 8, 2003, Pages 424-432, ISSN 0213-005X, https://doi.org/10.1016/S0213-005X(03)72980-2.

15. Ariza-Heredia, Ella J.; Razonable, Raymund R. Human Herpes Virus 8 in Solid Organ Transplantation. Transplantation 92(8): p. 837-844, Oct 27, 2011. | DOI: 0.1097/TP.0b013e31823104ec.

16. Eid, A. J., & Posfay-Barbe, K. M. (2009). Parvovirus B19 in Solid Organ Transplant Recipients. American Journal of Transplantation, 9, S147–S150. doi:10.1111/j.1600-6143.2009.02905.x.

17. Yawn BP, Gilden D. The global epidemiology of herpes zoster. Neurology. 2013 Sep 3;81(10):928-30. doi: 10.1212/WNL.0b013e3182a3516e.

18. Pergam SA, Limaye AP; AST Infectious Diseases Community of Practice. Varicella zoster virus in solid organ transplantation. Am J Transplant. 2013 Mar;13 Suppl 4(Suppl 4):138-46. doi: 10.1111/ajt.12107.

ПЛР Набори GeneProof для визначення інфекцій при трансплантації