ПЛР НАБОРЫ GENEPROOF ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНФЕКЦИЙ В ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ

Трансплантация органов — одно из величайших достижений медицины ХХ века, — продлевает жизнь и улучшает качество сотням тысяч пациентов по всему миру. Многочисленные акты самопожертвования со стороны доноров органов и их семей, так же как и многочисленные значительные научные и клинические успехи, достигнутые медиками, превратили трансплантацию не только в способ спасения жизни, но и в символ человеческой солидарности [1].

Ежегодно в Украине около 5 000 человек нуждаются в пересадке органов. Для них эта операция — единственный шанс на жизнь. На протяжении десятилетий после провозглашения независимости вопрос спасения людей, нуждающихся в пересадке, «висел в воздухе». Проводились лишь единичные посмертные органные трансплантации. В то же время от живого донора было проведено всего несколько десятков пересадок.

Поворотным моментом в трансплантации стало принятие изменений в Закон «О применении трансплантации анатомических материалов человеку» от 20.12.2019 года. Тогда же, после значительного перерыва, в Ковельской районной больнице при участии столичных врачей была проведена трансплантация сердца и почек от умершего донора [2].

(Источник — media.istockphoto.com)

Пациенты с ослабленным иммунитетом особенно уязвимы к обычным или оппортунистическим вирусным инфекциям. Они часто возникают после трансплантации солидного органа или гемопоэтических клеток, что сопровождается заболеваемостью и смертностью до 40%. Такие инфекции могут происходить от донора, быть внебольничными или соответствовать реактивации существующих латентных эндогенных вирусов пациента.

Успешная профилактика и раннее выявление вирусных инфекций, включая реактивацию, являются основными принципами ведения пациентов с трансплантатами. Для эффективных стратегий превентивного и терапевтического лечения важна точная количественная оценка вирусной нагрузки. Как правило, в иммунокомпрометированных организмах реактивация нескольких вирусов может происходить одновременно, что делает всестороннюю идентификацию патогенных вирусов, которые реплицируются, крайне важной. Мониторинг оппортунистических вирусных инфекций у пациентов после трансплантации чаще всего выполняется с помощью нескольких количественных ПЦР-анализов.

Среди производителей наборов в молекулярной диагностике для исследований пациентов с ослабленным иммунитетом или трансплантированными органами для ПЦР представлена всемирно известная компания GeneProof.

GeneProof — это биотехнологическая компания, работающая в области молекулярной диагностики серьезных инфекций и генетических заболеваний in vitro [3].

Портфолио GeneProof в первую очередь сосредоточено именно на инфекционных заболеваниях вирусного и бактериального генеза. Уделяя особое внимание качеству, GeneProof предлагает технологически передовые наборы для ПЦР в режиме реального времени [4].

Решением от GeneProof для диагностики пациентов с ослабленным иммунитетом или с трансплантированными органами являются следующие наборы:

Цитомегаловирус (CMV)

Цитомегаловирус человека является распространенной оппортунистической инфекцией среди лиц с ослабленным иммунитетом. Иммунитет таких людей максимально ослаблен из-за применения иммуносупрессии во время трансплантации солидных органов или трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК), а, следовательно, они склонны к реактивации CMV человека (латентного вируса), первичной инфекции и реинфекции. Инфекции CMV могут вызывать тяжелые заболеваемости и неудачные трансплантации, что часто приводит к длительному пребыванию в стационаре и значительно более высоким затратам на лечение. Трансплантация от серопозитивного лица серонегативному (R-/D+) представляет наибольший риск развития CMV-ассоциированного заболевания у пациентов-реципиентов. Поэтому определение серологического статуса реципиента и донора является важным для оценки риска развития CMV-ассоциированных заболеваний. Однако найти донора и реципиента с одинаковым серостатусом может быть трудно, и даже совпадение серостатуса не полностью исключает риск CMV-ассоциированной заболеваемости.

Скоординированный врожденный и адаптивный иммунный ответ имеет решающее значение для контроля CMV-инфекции у реципиентов с ослабленным иммунитетом. В то время как врожденные реакции интерферона (IFN) и естественных киллеров (NK) важны для непосредственного контроля над CMV-инфекцией, адаптивные Т-клеточные иммунные реакции важны как на стадии активной инфекции, так и на стадии контроля реактивации [5].

Вирус Эпштейна-Барр (EBV)

Вирус Эпштейна-Барр — широко распространенный вирус герпеса, который инфицирует большинство населения во всем мире. Вирус может создавать пожизненную латентную инфекцию в В-лимфоцитах хозяина. В условиях иммунологического компромисса, как это происходит после трансплантации, вирус может реактивироваться и вызвать одно из самых смертоносных осложнений после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) — постлимфопролиферативную болезнь (ПЛПХ), частота возникновения которой постоянно растет. С возникновением ПЛПХ связаны многочисленные факторы риска, такие как возраст, снижение интенсивности кондиционирования, несоответствие серологии EBV и реактивация цитомегаловируса. Редкость клинических исследований, включающих ПЛПХ, и отсутствие утвержденных методов лечения делают лечение ПЛПХ сложной задачей [6].

Вирус BK (BKV) и JC-вирус (JCV)

Вирусы полиомы повсеместно инфицируют много разных видов млекопитающих, в том числе и людей. Известно пять вирусов полиомы человека. Большинство заболеваний полиомой человека вызываются вирусами BK и JC, которые обычно приобретаются в детстве.

Примерно 50-80% людей являются серопозитивными к этим вирусам. Клинически выраженные заболевания у иммунокомпетентных носителей случаются крайне редко. Эти вирусы остаются латентными, вероятно, в лимфоидных органах, нейронной ткани и почках, а в условиях выраженной иммуносупрессии оба вируса реактивируются. Нейротропный вирус JC (JCV — вирус Джона Каннингема, John Cunningham) достигает головного мозга и вызывает прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию (ПМЛ), демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы с высоким уровнем смертности. Вирус ВК является уротелиотропным, и его реактивация вызывает форму интерстициального нефрита, известную как ВК или вирусоассоциированная нефропатия, которая связана с высокой потерей трансплантата, если ее не распознать на ранней стадии. Эффективных противовирусных препаратов ни против одного из вирусов полиомы не существует [7].

Вирус BK, впервые выделенный в 1971 году, является значительным фактором риска дисфункции почечного трансплантата и потери аллотрансплантата. К сожалению, возможности лечения BK-инфекции ограничены, а эффективной профилактики не существует. Хотя чрезмерная иммуносупрессия остается основным фактором риска инфицирования ВК после трансплантации, мужской пол, старший возраст реципиента, предыдущие эпизоды отторжения, степень несоответствия лейкоцитарных антигенов человека, длительное время холодовой ишемии, серостатус ВК и установка дренажного стента в мочеточнике также были признаны факторами риска. Доказано, что рутинный скрининг на ВК является эффективным для предотвращения потери аллотрансплантата у пациентов с вирурией или виремией BK-инфекции. Уменьшение иммуносупрессии остается основой лечения ВК-нефропатии и является наиболее изученным вмешательством. Лабораторные методы, такие как ELISPOT-анализ, предоставили новое понимание иммунного ответа на ВК и могут помочь направить терапию в будущем.

Вирус ВК можно обнаружить как в крови, так и в моче. После реактивации ВК вирус сначала обнаруживается в моче, а виремия развивается через несколько недель. Вирусная нагрузка ВК измеряется с помощью ПЦР в режиме реального времени [8].

Аденовирус

Аденовирусы как безоболочечные литические двухцепочечные ДНК-вирусы вызывают преимущественно респираторные, желудочно-кишечные или конъюнктивальные заболевания у иммунокомпетентных пациентов в течение года.

Несмотря на отсутствие консенсуса относительно определений аденовирусной инфекции и заболевания, обычно бессимптомная аденовирусная инфекция определяется как обнаружение аденовируса у пациентов в образцах кала, крови, мочи или верхних дыхательных путей (с помощью вирусной культуры, тестов на антигены или ПЦР методов) при отсутствии признаков и симптомов, связанных с аденовирусным заболеванием.

Аденовирусная болезнь определяется как наличие соответствующих признаков и симптомов со стороны органов в сочетании с выявлением аденовируса в биоптате (иммуногистохимическое окрашивание) или в бронхоальвеолярном лаваже или спинномозговой жидкости (культуральное исследование, выявление антигена или ПЦР), при отсутствии другого диагноза. Положительный результат ПЦР аденовируса из ткани или жидкости и отрицательный результат иммуногистохимического исследования не свидетельствует об инвазивном заболевании. Положительный результат ПЦР аденовируса из ткани или жидкости трудно интерпретировать при отсутствии иммуногистохимического подтверждения. Аденовирусная болезнь считается диссеминированной, если вовлечены два или более органов, не считая виремии. Способность аденовируса к латентному состоянию может привести к трудностям в интерпретации наличия ДНК в клинических образцах.

Доступными методами диагностики аденовирусных инфекций являются: вирусная культура, прямое выявление антигена, молекулярные методы и гистопатология. Серология и электронная микроскопия доступны, но не используются в клинической практике [9].

Aspergillus

За последние годы количество пациентов, которым проводят трансплантацию, возросло в экспоненциальном порядке. Реципиенты трансплантатов являются одной из наиболее значимых подгрупп иммуносупрессированных лиц, имеющих риск развития инвазивного аспергиллёза [10].

Виды Aspergillus являются основной причиной беспокойства здоровья людей с ослабленным иммунитетом во всем мире. Оппортунистические аспергиллы вызывают инвазивный аллергический аспергиллез, тогда как неинфекционные аспергиллы способствовали пониманию биологии эукариотических организмов и служат модельным организмом. Морфотипы аспергилл, такие как конидии или мицелий/гифы, помогают им выживать в благоприятных или неблагоприятных условиях окружающей среды. Эти морфотипы способствуют вирулентности, патогенности и инвазии в организм хозяина путем выделения белков, ферментов или токсинов [11].

Аспергиллез может быть доказан только гистологическим исследованием или посевом из физиологически стерильного источника. Теоретически это может быть культура крови, но в клинической практике рост аспергиллов из крови чрезвычайно редок. Кроме обнаружения антигенов в крови и других клинических образцах, выявление специфических последовательностей грибкового генома является еще одним методом, перспективным для ранней диагностики. С 1990-х годов различные методы ПЦР используются для выявления циркулирующей грибковой ДНК [12].

Вирус простого герпеса 1/2 (HSV-1/2)

Вирусы простого герпеса являются одними из наиболее распространенных среди инфекций человека. В большинстве случаев инфекции HSV у людей с неповрежденной иммунной системой протекают относительно мягко и могут вызывать дискомфорт, но часто остаются незамеченными. В редких случаях HSV может попадать в кровь, что приводит к более тяжелым проявлениям, которые поражают различные участки кожи, внутренние органы и центральную нервную систему. Это особенно актуально для новорожденных и лиц с ослабленным иммунитетом, для которых инфицирование или реактивация HSV может представлять угрозу для жизни.

У реципиентов трансплантации солидных органов инфицирование или реактивация HSV также может привести к более тяжелым проявлениям, включая эзофагит, гепатит, пневмонит и потенциальную потерю трансплантата. Поэтому диагностика инфекций, вызванных HSV, имеет решающее значение в клинических условиях. Ранняя диагностика позволяет своевременно назначить противовирусное лечение, влияет на решения по ведению пациентов с высоким риском и может способствовать сокращению сроков пребывания в больнице, тем самым уменьшая расходы на здравоохранение.

Для диагностики инфекций, вызванных HSV-1 и HSV-2, применяются различные методы, включая традиционные вирусные культуры, серологические тесты и тесты амплификации нуклеиновых кислот (NAAT). Среди данных методов диагностики широко используются ПЦР-методы благодаря своей высокой чувствительности и специфичности, а также короткому времени выполнения для выявления вирусной нуклеиновой кислоты [13].

Вирус герпеса 6 и 7 типа (HHV-6/7)

В последние годы растет интерес к роли вируса герпеса человека 6 и 7 типа как новых патогенов или копатогенов у реципиентов трансплантатов. HHV-6 и HHV-7 относятся к семейству β-герпесвирусов и тесно связаны с другим представителем этого семейства — цитомегаловирусом. После первичного инфицирования эти вирусы остаются латентными в организме человека и могут реактивироваться после трансплантации. Различные клинические процессы, такие как лихорадка, сыпь, пневмонит, энцефалит, гепатит и миелосупрессия, были описаны в ассоциации с герпесвирусом. Более того, растет количество доказательств того, что основное влияние реактивации HHV-6 и HHV-7 при трансплантации связано с косвенными эффектами, такими как их связь с цитомегаловирусной болезнью, увеличением количества оппортунистических инфекций, а также дисфункцией и отторжением трансплантата. Патогенез HHV-6 и HHV-7 в посттрансплантационном периоде, методы их диагностики, а также оценка противовирусных препаратов и стратегий их профилактики и лечения сейчас являются предметом широких исследований [14].

Вирус герпеса человека 8 типа (HHV-8)

Вирус герпеса человека 8 (HHV-8) — это географически ограниченный вирус, который вызывает неопластические заболевания преимущественно в эндемичных регионах. Первичная инфекция HHV-8, которая обычно протекает бессимптомно у иммунокомпетентных лиц, приводит к пожизненной латентности. Когда равновесие между вирусом и иммунитетом хозяина нарушается, например, после трансплантации органов, HHV-8 может активировать молекулярные пути, которые приводят к онкогенезу.

Саркома Капоши, первичная лимфома и болезнь Кастлемана являются основными злокачественными заболеваниями, которые ассоциируются с HHV-8. Частота возникновения этих неопластических патологий отражает географическую распространенность серопозитивности HHV-8, а определенные группы пациентов подвергаются повышенному риску.

В этом контексте риск инфицирования HHV-8 и его клинических проявлений является самым высоким у пациентов с ослабленным иммунитетом, включая реципиентов трансплантатов.

У реципиентов солидных органов из эндемичных регионов может развиться реактивация HHV-8 или первичная инфекция, проявляющаяся саркомой Капоши или, реже, первичной эффузионной (выпотной) лимфомой (ПЕЛ) и болезнью Кастлемана; эти неопластические заболевания значительно реже регистрируются в регионах с низким уровнем распространенности вируса.

Пока не существует стандартного метода скрининга HHV-8 инфекции при трансплантации, хотя ПЦР-метод HHV-8 доступен для подтверждения клинического подозрения на инфекцию [15].

Парвовирус В19

Парвовирус В19 является широко распространенным патогеном человека. Это небольшой одноцепочечный линейный ДНК-вирус без оболочки. Его генетическая изменчивость в мире низкая, и нет четкой корреляции между генотипом и характерными клиническими проявлениями. Парвовирус В19 наиболее эффективно и преимущественно реплицируется в предшественниках эритроцитов человека. Большинство людей инфицируются в возрасте от 5 до 15 лет; во взрослом возрасте до 80% являются серопозитивными.

Инфекция, предоставляет пожизненный иммунитет иммунокомпетентным носителям, но повторное инфицирование возможно в меньшинстве случаев. Существует гипотеза, что парвовирус B19 может персистировать в костном мозге и других тканях, поддерживая возможную реактивацию, а не реинфекцию у некоторых серопозитивных пациентов. Инфекция, вызванная парвовирусом B19, может протекать как симптоматически, так и бессимптомно, в зависимости от возраста, гематологического и иммунологического статуса носителя. Хотя большинство пациентов имели лишь неспецифические гриппоподобные симптомы, с инфекцией Parvovirus B19 связаны отличные клинические проявления как у иммунокомпетентных носителей, так и у реципиентов трансплантации солидных органов.

Современное использование метода ПЦР значительно улучшило выявление вирусной ДНК. Однако некоторые ПЦР тесты не способны выявлять штаммы, отличные от В19 (генотипы 2 и 3). Кроме того, ДНК парвовируса В19 может быть обнаружено с помощью ПЦР в сыворотке крови некоторых пациентов в течение длительного времени после острой фазы инфекции. Таким образом, положительный результат ПЦР на парвовирус В19 необходимо тщательно интерпретировать в контексте клинической ситуации и других лабораторных результатов [16].

Varicella-Zoster (VZV)

Вирус ветряной оспы (Varicella-zoster virus) — это повсеместно распространенный высоконейротропный, исключительно человеческий α-герпесвирус. Первичное инфицирование обычно приводит к ветряной оспе, после чего VZV становится латентным в нейронах черепно-мозговых нервных ганглиев, дорсальных корешковых ганглиев и вегетативных ганглиев вдоль всего невраксиса. Поскольку с возрастом у людей происходит естественное снижение клеточного иммунитета к VZV, вирус часто реактивируется и вызывает опоясывающий лишай, который характеризуется макулопапулезной или везикулярной сыпью и дерматомикроскопической болью, распространяющейся по всему телу. Боль и сыпь обычно появляются в течение нескольких дней [17].

Точные лабораторные исследования могут быть использованы в различных случаях VZV или опоясывающего герпеса и должны регулярно проводиться при подозрении на диссеминированные, висцеральные заболевания или заболевания центральной нервной системы. Методами выбора являются быстрые методы диагностики, включая ПЦР и прямой флуоресцентный анализ (ПФА). ПЦР тестирование является самым чувствительным тестом на VZV, который может быть использован для выявления висцерального поражения в везикулярной жидкости, сыворотке, спинномозговой жидкости и других тканях [18].

ВЫВОДЫ

В связи с растущими темпами трансплантаций в Украине начиная с конца 2019 года, количество ПЦР исследований только растет как для доноров, так и для реципиентов. ПЦР диагностику часто проводят превентивно, с целью предотвращения заболеваний у реципиентов трансплантации, а также для диагностики острого или реактивированного заболевания и мониторинга ответа на терапию. Наборы GeneProof помогут исследователю в поставленных задачах. Высокое качество данных наборов и простота выполнения исследований включают в себя следующие основные пункты:

один рабочий процесс позволяет объединить ПЦР-наборы из разных диагностических групп в одном тесте с помощью универсального ПЦР-протокола, а универсальный ПЦР-протокол позволяет одновременно определять несколько параметров в одном цикле, даже ДНК и РНК патогенов одновременно;
универсальный внутренний контроль — еще один шаг к упрощению рабочего процесса в лаборатории, особенно когда несколько исследований объединяются в одной постановке; использование только одного универсального внутреннего контроля в начале процесса вместо добавления нескольких конкретных внутренних контролей будет способствовать еще большей эффективности;
двойное определение мишеней обеспечивает правильную идентификацию патогенов и высокую чувствительность благодаря одновременному выявлению двух независимых участков генов ДНК/РНК.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. www. utcc.gov.ua/transplantatsiya/pytannya-shho-stavlyatsya-najchastishe/

2. www. moz.gov.ua/uk/transplantacija-v-ukraini-jak-zminilas-galuz-za-ostanni-4-roki

3. www.geneproof.com/about-geneproof/t1054

4. www.geneproof.com/benefits-of-geneproof-pcr-kits/t1105.

5. Sezgin, E., An, P., & Winkler, C. A. (2019). Host Genetics of Cytomegalovirus Pathogenesis. Frontiers in Genetics, 10. doi:10.3389/fgene.2019.00616.

6. Al Hamed, R., Bazarbachi, A. & Mohty, M. Epstein-Barr virus-related post-transplant lymphoproliferative disease (EBV-PTLD) in the setting of allogeneic stem cell transplantation: a comprehensive review from pathogenesis to forthcoming treatment modalities. Bone Marrow Transplant 55, 25–39 (2020). https://doi.org/10.1038/s41409-019-0548-7.

7. Boothpur R, Brennan D.C. Human polyoma viruses and disease with emphasis on clinical BK and JC. J Clin Virol. 2010 Apr;47(4):306-12. doi: 10.1016/j.jcv.2009.12.006.

8. Deirdre Sawinski, Simin Goral, BK virus infection: an update on diagnosis and treatment, Nephrology Dialysis Transplantation, Volume 30, Issue 2, February 2015, Pages 209–217, doi.org/10.1093/ndt/gfu023.

9. Florescu D. F, Schaenman J. M; AST Infectious Diseases Community of Practice. Adenovirus in solid organ transplant recipients: Guidelines from the American Society of Transplantation Infectious Diseases Community of Practice. Clin Transplant. 2019 Sep;33(9):e13527. doi: 10.1111/ctr.13527.

10. Singh N, Paterson DL. 2005. Aspergillus Infections in Transplant Recipients. Clin Microbiol Rev 18: https://doi.org/10.1128/cmr.18.1.44-69.2005.

11. Shankar, J., Tiwari, S., Shishodia, S. K., Gangwar, M., Hoda, S., Thakur, R., & Vijayaraghavan, P. (2018). Molecular Insights Into Development and Virulence Determinants of Aspergilli: A Proteomic Perspective. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 8. doi:10.3389/fcimb.2018.00180.

12. Maschmeyer, G., Haas, A., & Cornely, O. A. (2007). Invasive Aspergillosis. Drugs, 67(11), 1567–1601. doi:10.2165/00003495-200767110-00004.

13. Zhen W, Sheikh F, Breining DA, Berry GJ. 2024. Rapid diagnosis of herpes simplex virus 1 and 2 bloodstream infections utilizing a sample-to-answer platform. J. Clin. Microbiol. 62:e00131-24. https://doi.org/10.1128/jcm.00131-24.

14. Natividad Benito, Asunción Moreno, Tomás Pumarola, M.ª Ángeles Marcos, Virus del herpes humano tipo 6 y tipo 7 en receptores de trasplantes, Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, Volume 21, Issue 8, 2003, Pages 424-432, ISSN 0213-005X, https://doi.org/10.1016/S0213-005X(03)72980-2.

15. Ariza-Heredia, Ella J.; Razonable, Raymund R. Human Herpes Virus 8 in Solid Organ Transplantation. Transplantation 92(8): p. 837-844, Oct 27, 2011. | DOI: 0.1097/TP.0b013e31823104ec.

16. Eid, A. J., & Posfay-Barbe, K. M. (2009). Parvovirus B19 in Solid Organ Transplant Recipients. American Journal of Transplantation, 9, S147–S150. doi:10.1111/j.1600-6143.2009.02905.x.

17. Yawn BP, Gilden D. The global epidemiology of herpes zoster. Neurology. 2013 Sep 3;81(10):928-30. doi: 10.1212/WNL.0b013e3182a3516e.

18. Pergam S. A., Limaye A. P.; AST Infectious Diseases Community of Practice. Varicella zoster virus in solid organ transplantation. Am J Transplant. 2013 Mar;13 Suppl 4(Suppl 4):138-46. doi: 10.1111/ajt.12107.

ПЦР Наборы GeneProof для определения инфекций при трансплантации